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　　專利公布號：CN 106318930 A

　　申請人：華南理工大學(xué)

　　發(fā)明人：王永華　藍(lán)東明　張澤棟　楊博　周鵬飛

　　提供一種以高溫酯酶TTEST為主的復(fù)合酶制劑去除廢紙漿中膠黏物的方法。

　　步驟如下：

　　(1)高溫酯酶TTEST的制備：

　　將酯酶TTEST菌種接種到種子液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，再將菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，制備得到高溫酯酶TTEST粗酶液，將高溫酯酶TTEST粗酶液純化，用對硝基苯酚比色法測定高溫酯酶TTEST的酶活。

　　利用全基因合成方法獲取的TTEST酯酶的編碼基因，并克隆到表達(dá)載體pET23a-CBD載體上獲得重組表達(dá)載體。利用CaCl2轉(zhuǎn)化法，將含有TTEST酯酶編碼基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)菌種中，獲得基因工程菌。將酯酶TTEST的菌種接到含Amp(100ug/ml)的LB種子培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)OD值達(dá)到0.6～0.8時，將菌液按照1:100的比例接種到含Amp(100ug/ml)的L B發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖至OD值為0.6～0.8時加入I PTG(20mmol/L)誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，18～24h后收菌。將菌液在12000r/min條件下離心10min后收集管壁細(xì)胞進(jìn)行超聲破碎，之后再以12000r/min條件離心10min后取上清液，即得到粗酶液。利用纖維素與酯酶進(jìn)行特異性結(jié)合，之后再用3C蛋白酶進(jìn)行酶切從而得到純酶。1L菌液對應(yīng)1g纖維素，常溫下將粗酶液與纖維素結(jié)合30min，適時攪拌。結(jié)合后高速離心10min，棄去上清液，將吸附蛋白用PBS緩沖液洗兩次。3C蛋白酶在使用前先離心、棄去上清，利用PBS緩沖液清洗2次。向吸附蛋白中加入適量PBS，按1L菌液對應(yīng)1ml 3C蛋白酶的比例混勻后酶切4h或過夜。酶切后高速離心，上清液即為純酶。之后利用對硝基苯酚比色法測定制備的高溫酯酶TTEST的酶活，測得酶活為3500U/g。脂肪酶CALB為商品化脂肪酶，測得酶活為150.0U/ml。

　　(2)按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計，將高溫酯酶TTEST(45%～50%)與淀粉酶(15%～20%)、果膠酶(10%～15%)、木聚糖酶(10%～15%)、甘油(5%)、聚乙二醇(5%)、水(5%～10%)復(fù)配成復(fù)合酶制劑。

　　(3)稱取100g OCC絕干漿，稀釋到相應(yīng)漿濃，添加一定量的酶，在一定的處理溫度、pH值、處理時間、攪拌轉(zhuǎn)速下(如表1)，按照TAPPIT-277膠黏物測定法利用Pulmac-MasterScreen篩分儀將漿料進(jìn)行篩選，之后將篩出的膠黏物進(jìn)行染色、壓片，最后用掃描軟件進(jìn)行分析掃描，進(jìn)而測得酶處理后的膠黏物含量。

　　在不加酶的情況下，用其余相同條件處理廢紙漿，實驗測定結(jié)果為空白組膠黏物含量。

　　復(fù)合酶制劑的添加量為廢紙漿絕干漿質(zhì)量的0.1%～1.0%，處理溫度為40～80℃，處理時間45～120min，pH為6.0～9.0，攪拌轉(zhuǎn)速為100～150r/min。

　　復(fù)合酶處理廢紙漿的溫度為50～55℃，復(fù)合酶處理廢紙漿的攪拌條件為120r/min，反應(yīng)時間為60min。復(fù)合酶的添加量為廢紙漿絕干漿質(zhì)量的0.3%～0.5%。復(fù)合酶處理廢紙漿的pH為7.0～8.0。廢紙漿的漿濃為4%～6%。

　　高溫酯酶的酶活為3500U/g。淀粉酶酶活為5000U/g，果膠酶酶活為5000U/g，木聚糖酶酶活為10000U/g。

　　由表1可知，在40～55℃條件下，加入復(fù)合酶處理后的廢紙漿中膠黏物含量明顯減少，膠黏物去除率可達(dá)60.8%～74.1%，要明顯優(yōu)于脂肪酶CALB的去除效果。即使在80℃高溫條件下，加入復(fù)合酶后的處理效果也較為理想，廢紙漿中的膠黏物去除率達(dá)到58.5%，而脂肪酶CALB在此條件下基本失活，難以去除膠黏物。考慮到廢紙造紙過程中不同工段的溫度不盡相同，酯酶PCEST在廢紙回收不同工段中去除膠黏物的效果都較為理想。

　　與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果：

　　(1)高溫酯酶TTEST制備較為容易，效果明顯。

　　(2)復(fù)合酶制劑可以應(yīng)對廢紙回收工藝中的各種高溫以及酸堿環(huán)境，在高溫條件下仍能保持較好的膠黏物去除效果。

　　(3)通過以高溫酯酶為主的復(fù)合酶制劑去除廢紙膠黏物的方法可直接在生產(chǎn)線上進(jìn)行，無須增加任何機(jī)械設(shè)備，操作簡單，成本低。

　　因此，通過以高溫酯酶為主的復(fù)合酶制劑控制廢紙漿中的膠黏物的方法高效、穩(wěn)妥地解決了過去在廢紙造紙領(lǐng)域嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量膠黏物問題，具有操作簡單、去除效果顯著、生產(chǎn)成本低、無污染等優(yōu)點。